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实验室人员:
PI:童雪梅
讲师:张萍
助理研究员:吴丽芳
实验师:李亚葵,朱晔敏
博士生:卢颖、冯明、李亚葵
硕士生:田娜
 
研究进展:
  本研究组将长期致力于研究细胞代谢和细胞死亡的生化和分子调节机制及其在防治代谢相关疾病如癌症、肥胖症、糖尿病中的应用。现阶段我们有三个主要研究方向:
1)研究转录因子ChREBP在调节肿瘤细胞代谢、增殖和肿瘤生成中的作用和机制;
2)研究转录因子ChREBP在调节脂肪细胞代谢、增殖、分化中的作用和机制;
3)研究Bax和Bak调控毛发周期和皮肤干细胞的分子机制。
 
研究进展:
1.ChREBP的转录复合体组成和转录调控机制研究
我们已发表的研究表明降低ChREBP表达可以抑制结肠癌细胞增殖和肿瘤生长。这项研究首次揭示了ChREBP在结肠癌细胞代谢中起到调控糖酵解、脂肪酸合成和核酸合成等多条代谢途径的重要作用,并且ChREBP通过调控代谢途径而影响细胞活性氧ROS水平和抑癌蛋白p53活性,最终调节结肠癌细胞增殖和肿瘤生长。因此,研究ChREBP的转录调控机制将有助于从代谢角度分析结肠癌的发病机理,并且为设计针对转录因子ChREBP及其调控的代谢酶基因的小分子药物提供创新性思路。然而,至今有关转录共激活因子或共抑制因子调节ChREBP转录活性的报道非常有限。
  我们从寻找结肠癌细胞中与ChREBP相互作用蛋白入手研究调控ChREBP转录活性的分子机制。通过结肠癌HCT116细胞内源ChREBP免疫沉淀、SDS-PAGE电泳,银染和质谱分析,我们发现多个可能与ChREBP结合的蛋白(图1)。其中,FLII (Flightless-I protein homolog)引起我们的重视,因为已知FLII是多种核受体类蛋白的转录共激活因子。我们已经使用免疫共沉淀和免疫染色共定位的方法证实FLII与ChREBP存在相互作用。
图1. 分析结肠癌HCT116细胞中ChREBP的相互作用蛋白。A:HCT116细胞裂解后,经ChREBP兔抗体和未经免疫的兔血清免疫沉淀,SDS-PAGE后进行银染分析。与未经免疫的兔血清免疫沉淀物(Rabbit serum IP)比较,多个蛋白银染条带(用?标记)特异性存在于ChREBP免疫沉淀物(ChREBP IP)中。质谱分析后发现*所指示特异性蛋白条带为FLII。B:人FLII的氨基酸序列,其中12个肽段氨基酸序列(黑体标记)与质谱分析结果一致。
  我们使用scansite(http://scansite.mit.edu/)对于FLII 的功能区域进行预测,发现人FLII蛋白氨基酸162-167(RLESLP)区为高度保守的14-3-3结合区域。FLII和ChREBP在细胞质和细胞核均有表达,其在细胞内不同区域的动态分布可以调节这两个蛋白的功能。14-3-3与ChREBP结合并调控其在细胞核与细胞质的分布比例。迄今为止尚无14-3-3与FLII结合的报道。我们将165位丝氨酸(S)突变为丙氨酸(A),发现与野生型FLII相比, FLIIS165A突变体在细胞核中分布明显增加(图3)。并且FLIIS165A突变体明显增强ChREBP转录活性。因此,FLII很可能作为ChREBP转录复合体内的共激活因子而调控ChREBP的转录活性。
图2. FLII与ChREBP的相互作用分析。A. 293T细胞中,过量表达的FLAG-FLII和MYC-ChREBP免疫共沉淀;B. HCT116细胞中,内源性FLII与ChREBP蛋白免疫共沉淀;C. Hela细胞中过量表达的FLAG-FLII和MYC-ChREBP免疫共定位。
图3. S165A突变导致FLII在细胞核中分布明显增加。Hela细胞转染入GFP-FLII或GFP-FLIIS165A后,使用GFP荧光观察FLII的细胞内定位。DAPI为标记细胞核的染料。Merge为GFP和DAPI整合后的图像。
图4. 293T细胞中,过量表达的FLAG-ChREBP和MYC-HDAC1免疫共沉淀。
图5. 293T细胞中,过量表达的Myc-ChREBP和FLAG-HDAC3免疫共沉淀。
 
2.乙酰化修饰调控ChREBP转录活性的研究
  近期研究表明小鼠正常肝脏和胰腺细胞中ChREBP与乙酰转移酶p300结合并且p300可以调节ChREBP转录活性,但是肝癌细胞中是否存在类似现象有待进一步研究。另一方面,为了阐明ChREBP乙酰化修饰的分子调控机制,我们试图寻找与ChREBP结合的去乙酰化酶。我们在293T细胞中过量表达ChREBP和已知的各种去乙酰化酶,使用免疫共沉淀的方法分析其是否存在相互作用。我们发现ChREBP与去乙酰化酶HDAC1和HDAC3免疫共沉淀(图4-5)。下一步我们将研究肝癌细胞中ChREBP与去乙酰化酶HDAC1和HDAC3相互作用的分子机制。
3.乳酸是否及如何调控Mondo家族转录因子(MondoA和ChREBP)转录活性的研究
  肿瘤细胞能够快速摄取微环境中的葡萄糖,通过糖酵解产生大量乳酸分泌到微环境中。除葡萄糖外,谷氨酰胺等氨基酸代谢过程中也能够生成乳酸。多项研究表明乳酸对于肿瘤细胞的转移、浸润、血管生成有明显促进作用。对于病人肿瘤组织的定量生物萤光成像技术(quantitative bioluminescence imaging)表明结肠癌、宫颈癌和头颈癌病人癌组织内乳酸含量与癌细胞转移率呈正相关,与病人存活时间呈负相关。
  在乳酸处理乳腺癌MCF7细胞的基因表达谱分析中发现,转录因子MondoA的转录活性尤其是与特定靶基因启动子结合能力在高浓度乳酸条件下得以增强。MondoA是Mondo家族转录因子中的一员,在哺乳动物中Mondo家族转录因子主要包括MondoA和ChREBP(又称为MondoB)。Mondo家族转录因子与Myc家族转录因子在序列上有一定同源性,能够感知细胞内营养物如葡萄糖、谷氨酰胺和脂肪酸水平从而通过调控转录来调节代谢、增殖等生理过程。在组织水平,MondoA和ChREBP具有不同的“代谢组织特异性”,MondoA在骨骼肌高表达而ChREBP在肝脏和脂肪组织中高表达。在细胞水平,Mondo家族转录因子可以定位在细胞质和细胞核中,其细胞内动态分布受代谢中间产物调控。Mondo家族转录因子直接调控的靶基因包括糖酵解和脂肪酸合成中的多个关键酶基因。MondoA和ChREBP在调节骨骼肌、脂肪和肝脏的细胞糖脂代谢中起重要作用,但是它们在肿瘤细胞中的功能却知之甚少。
  在结肠癌细胞中,除ChREBP外,Mondo家族的另一转录因子MondoA表达量也较高,我们初步探索了通过RNA干扰抑制MondoA对于结肠癌细胞增殖和代谢的影响,并与抑制ChREBP表达的情况进行比较。我们的实验结果表明,与ChREBP类似,MondoA的表达对结肠癌细胞维持快速增殖是必需的。抑制MondoA或ChREBP表达引起细胞增殖减慢主要是因为细胞周期阻滞所致,与细胞死亡无。在肿瘤细胞中抑制MondoA或ChREBP的表达都会导致有氧糖酵解活性降低。有趣的是,在裸鼠成瘤实验中,我们发现两个HCT116  ChREBP shRNA稳转株都有效抑制ChREBP表达,但是细胞成瘤能力大不相同。8号稳转株成瘤能力与对照(V)类似,都远大于1号稳转株。其原因很可能是8号稳转株中MondoA表达量增加,补偿了表达受抑制的ChREBP。所以MondoA或ChREBP对于结肠癌细胞增殖和肿瘤生长都很重要,并且在功能上存在互补性。我们的前期研究也发现过量表达的MondoA和ChREBP免疫共沉淀。当MondoA和ChREBP在肿瘤细胞中共同表达时,二者可能形成转录复合体共同发挥作用。
图7. 结肠癌HCT116 细胞中抑制ChREBP 或MondoA 表达导致细胞周期阻滞。在HCT116 细胞中分别转染对照siRNA (Ctrl),两种不同ChREBP siRNA(ChREBP1 和ChREBP2)和两种不同MondoA siRNA(MondoA1和MondoA2)。转染72 小时后进行2 小时BrdU 标记,然后使用流式细胞仪进行细胞周期分析。
图8. 结肠癌HCT116 细胞中抑制ChREBP 或MondoA 表达减少葡萄糖摄取量和乳酸生成量。在HCT116 细胞中分别转染对照siRNA (Ctrl),两种不同ChREBP siRNA(ChREBP1和ChREBP2)和两种不同MondoA siRNA(MondoA1 和MondoA2)。转染72 小时后测定葡萄糖摄取量和乳酸生成量。
图9. ChREBP 或MondoA 表达量决定结肠癌HCT116 细胞在裸鼠中的成瘤能力。两个HCT116 ChREBP shRNA稳转株(编号1 和8)都有效抑制ChREBP 表达,但是细胞成瘤能力大不相同。8 号稳转株成瘤能力与对照(V)类似,远大于1 号稳转株。肿瘤组织的免疫印迹结果表明8 号稳转株中MondoA 表达量增加,很可能补偿了表达受抑制的ChREBP。2396-2400 为不同裸鼠编号。
 

 

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